Espressione genica condizionale mediata da lentivirus

La capacità di identificare il ruolo di un particolare gene in   un sistema   dipende dal controllo dell’espressione di quel gene. In questo protocollo descriviamo un metodo per l’espressione condizionale stabile dei recettori Nod-Like (NLR) nelle cellule THP-1 utilizzando un   sistema di   espressione  lentivirale  . Questo sistema  combina tutti i componenti necessari per l’espressione genica indotta dalla tetraciclina in un singolo lentivettore con la coespressione costitutiva di un marcatore selezionabile, che è un modo efficiente per controllare l’espressione genica utilizzando una singola infezione virale delle cellule. Questo viene fatto sulla piattaforma di espressione  di lentivirus di terza generazione  , che migliora la sicurezza dei lentivirus e consente una maggiore espressione genica rispetto alle piattaforme precedenti lentivirale.
  • Il plasmide di espressione  del lentivirus   viene prima progettato per contenere il gene di interesse guidato dal promotore TRE (elemento di risposta alla tetraciclina) in una semplice fase di clonazione del gate, e quindi co-trasfettato nelle cellule HEK293T insieme ai   plasmidi di  confezionamento e involucro per   produrre il virus.
  • Il virus viene utilizzato per infettare il tipo cellulare di interesse a un MOI basso tale che la maggior parte delle cellule trasdotte contenga una singola integrazione virale. Le cellule infette vengono coltivate con la selezione e l’integrazione del virus viene verificata mediante qPCR.
  • L’espressione genica nelle cellule trasdotte stabilmente è indotta dalla doxiciclina e convalidata da qPCR, immunoblotting e citometria a flusso.
  •   Questa piattaforma di espressione  lentivirale flessibile   può essere utilizzata per indurre in modo stabile e forte un gene di interesse in una varietà di cellule per una varietà di applicazioni. Riepilogo grafico: una panoramica schematica della  trasduzione lentivirale   nelle cellule THP-1.

Impatto minimo di ZAP sulla  produzione di vettori lentivirali   e sull’efficienza di trasduzione

  1. La proteina ZAP antivirale lega i dinucleotidi CpG sull’RNA virale, inibendo la replicazione. Ciò probabilmente ha portato alla soppressione di CpG osservata in molti virus a RNA, inclusi i retrovirus. Le sequenze aggiunte ai genomi dei vettori retrovirali, come promotori interni, transgeni o elementi regolatori, aumentano notevolmente l’abbondanza di CpG. Poiché questi CpG possono consentire a ZAP di indirizzare il vettore RNA retrovirale, abbiamo analizzato se questa riduzione della produzione del vettore, dell’efficienza di trasduzione e dell’espressione del transgene.
  2. Sorprendentemente, sebbene l’HIV-1 ad alto contenuto di CpG sia stato effettivamente inibito da ZAP nelle cellule HEK293T, l’esaurimento di ZAP non ha aumentato significativamente il titolo del   vettore lentivirale utilizzando diversi    plasmidi genomici e  di confezionamento . Anche la sovraespressione di ZAP non ha inibito il titolo del  vettore lentivirale. Inoltre, una riduzione dell’abbondanza di CpG nel genoma del  vettore lentivirale   non ha aumentato il suo titolo  e il vettore gammaretrovirale derivato dal virus della leucemia murina non è stato significativamente limitato da ZAP.
  3. Nel complesso, dimostriamo che la maggiore quantità di CpG nei vettori retrovirali rispetto ai retrovirus di tipo selvaggio da cui derivano non li rende intrinsecamente sensibili allo ZAP. Un’ulteriore comprensione del modo in cui ZAP mira specificamente alle trascrizioni per inibire la loro espressione può consentire lo sviluppo di contesti di sequenza CpG che reclutano o aggirano con successo questo   sistema  antivirale .

Guida alla  produzione di vettori lentivirali   per cellule difficili da trasfettare utilizzando cellule che esprimono c-kit derivate dal cuore come   sistema modello

  • La terapia genica è la modifica del corredo genetico mediante l’introduzione di acidi nucleici estranei nelle cellule bersaglio attraverso metodi di rilascio genico per il trattamento di una specifica malattia.
  • Sebbene i geni bersaglio svolgano un ruolo chiave nella terapia genica, anche il  sistema di rilascio del gene utilizzato  è di grande importanza nel determinare il successo della terapia genica. Poiché le cellule primarie e le cellule staminali sono spesso bersagli della terapia genica negli studi clinici,   il sistema di somministrazione  dovrebbe essere robusto e le voci basate su virus come i  vettori lentivirali   funzionano meglio per trasportare il transgene nelle cellule. Tuttavia, anche all’interno  dei vettori lentivirali   , diversi parametri possono influenzare la funzionalità   del sistema di rilascio  .
  • Utilizzando cellule che esprimono c-kit (CC) derivate dal cuore come sistema modello   ,  il presente studio mira a ottimizzare la  produzione lentivirale   studiando vari fattori sperimentali come la  produzione del sistema lentivirale  , il  metodo di concentrazione e il tipo di marcatore selezionabile. I nostri risultati hanno mostrato che il sistema di seconda generazione   con   pCMV-dR8.2 dvpr come  plasmide di confezionamento ha comportato   un’efficienza di produzione  di lentivirus 7,3 volte superiore  rispetto a psPAX2.
  • La concentrazione del virus dell’ultracentrifuga ha determinato un titolo del virus più elevato a oltre 5×105  unità infettive   /ml (IFU/ml). Infine, la concentrazione inibitoria minima (MIC) del marcatore di selezione della puromicina era di 10 µg/ml e 7 µg/ml per HEK293T e CC, indicando l’utilità della selezione di antibiotici per tutti i tipi cellulari. Questi dati incoraggianti possono essere estrapolati e applicati ad altre cellule difficili da trasfettare, come diversi tipi di cellule staminali o cellule primarie.

Sistema cellulare di confezionamento inducibile per la produzione sicura ed efficiente di vettori lentivirali in assenza di proteine ​​helper dell’HIV-1.

  • I vettori lentivirali basati sul virus dell’immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) hanno la capacità di fornire geni esogeni a cellule in divisione e non e quindi stabilire un provirus stabile in queste cellule bersaglio, che può consentire l’espressione a lungo termine del trasferimento gene. Qui descriviamo una linea cellulare di confezionamento stabile che è priva di HIV-1 tat, vif, vpr, vpu e nef. Al fine di evitare qualsiasi rischio di citotossicità associato all’espressione costitutiva della proteasi HIV-1 o  della proteina dell’involucro VSV-G, la trascrizione del pacchetto e dei costrutti dell’involucro è stata strettamente controllata mediante l’uso di un sistema indotto da ecdisone  .
  • Usando questa linea cellulare, siamo stati in grado di generare costantemente stock concentrati di vettori virali pseudotipizzati con titoli nell’intervallo di 10 (8) UI / ml, che possono trasdurre in modo efficiente cellule in vitro che si dividono attivamente e inibiscono la crescita. Questa nuova linea cellulare di confezionamento di vettori lentivirali facilita la produzione di stock di virus ad alto titolo in assenza di virus competenti per la replicazione e ci fornisce uno strumento importante per la futura ricerca sul trasferimento genico.

Generazione,   confezionamento  e trasduzione di virus su piattaforma microfluidica digitale

  1. I sistemi virali  sono un metodo di consegna popolare per l’introduzione di materiale genetico esogeno nelle cellule dei mammiferi. Sfortunatamente, la preparazione dei lentivirus contenenti il ​​macchinario per l’editing cellulare è laboriosa e le fasi richiedono ottimizzazione e manipolazione delicata. Per mitigare queste sfide, stiamo introducendo il primo metodo microfluidico che combina   produzione, confezionamento  e trasduzione  di lentivirus  . Il nuovo metodo consente la  produzione di titoli virali compresi tra  106   e  107   (simile alla produzione su macroscala) e un’elevata efficienza di trasduzione per linee cellulari difficili da trasfettare.

ViraSafe Lentiviral Expression System (Neo) Ecotropic

VPK-213-ECO Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Lentiviral Expression System (Neo), Pantropic

VPK-213-PAN Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Lentiviral Expression System (Hygro), Ecotropic

VPK-214-ECO Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Lentiviral Expression System (Hygro), Pantropic

VPK-214-PAN Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Lentiviral Bicistronic Expression System (Puro), Ecotropic

VPK-215-ECO Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Lentiviral Bicistronic Expression System (Puro), Pantropic

VPK-215-PAN Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Lentiviral Bicistronic Expression System (Neo), Ecotropic

VPK-216-ECO Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Lentiviral Bicistronic Expression System (Neo), Pantropic

VPK-216-PAN Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Lentiviral Bicistronic Expression System (Hygro), Ecotropic

VPK-217-ECO Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Lentiviral Bicistronic Expression System (Hygro), Pantropic

VPK-217-PAN Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Lentiviral Bicistronic Expression System (Blasticidin), Ecotropic

VPK-219-ECO Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

ViraSafe Lentiviral Bicistronic Expression System (Blasticidin), Pantropic

VPK-219-PAN Cell Biolabs 1 kit 1163 EUR

AAV-DJ Helper Free Packaging System

VPK-400-DJ Cell Biolabs 1 kit 972 EUR

AAV-1 Helper Free Packaging System

VPK-401 Cell Biolabs 1 kit 972 EUR

AAV-2 Helper Free Packaging System

VPK-402 Cell Biolabs 1 kit 972 EUR

AAV-3 Helper Free Packaging System

VPK-403 Cell Biolabs 1 kit 972 EUR

AAV-4 Helper Free Packaging System

VPK-404 Cell Biolabs 1 kit 972 EUR

AAV-5 Helper Free Packaging System

VPK-405 Cell Biolabs 1 kit 972 EUR

AAV-6 Helper Free Packaging System

VPK-406 Cell Biolabs 1 kit 972 EUR

AAV-DJ/8 Helper Free Packaging System

VPK-400-DJ-8 Cell Biolabs 1 kit 972 EUR

Lentivirus Packaging Kit

P904 101Bio - Ask for price

Retrovirus Packaging Kit

P905 101Bio - Ask for price

SynaptoGreenâ„¢ C3 (special packaging): (5x1mg)

70026 Biotium 5ST 320 EUR

SynaptoGreen C5 (special packaging): (5x1mg)

70047 Biotium 5ST 320 EUR

Gryphon Packaging Cell Selection Medium

ABP-TC-PHSM050 Allele Biotech 50 ml Ask for price

pPACKF1 FIV Lentivector Packaging Kit

LV100A-1 SBI 10 transfections 616 EUR

pPACKH1 HIV Lentivector Packaging Kit

LV500A-1 SBI 10 transfections 591 EUR

pPACK-ID: Integrase-defective lentiviral packaging mix (15 reactions)

LV520A-ID SBI 15 reactions 697 EUR

pPACK-ID: Integrase-defective lentiviral packaging mix (30 reactions)

LV525A-ID SBI 30 reactions 1132 EUR

pPACKH1-XL HIV Lentivector Packaging Kit

LV510A-1 SBI 25 transfections 1242 EUR

Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic

RV-101 Cell Biolabs 1 vial 920 EUR

Platinum-A Retroviral Packaging Cell Line, Amphotropic

RV-102 Cell Biolabs 1 vial 920 EUR

Platinum-GP Retroviral Packaging Cell Line, Pantropic

RV-103 Cell Biolabs 1 vial 920 EUR

pPACKF1 FIV Lentivector Packaging Kit (50 reactions)

LV100A-5 SBI 50 transfections 2341 EUR

ProtoBlock System

NAT1004 National Diagnostics 1KIT 102 EUR

data acquisition system

D230 Consort ea 1704 EUR

CCD cooling system

3600100 Atto 1unit 4914 EUR

Fast Mutagenesis System

20-abx098073 Abbexa
  • 509.00 EUR
  • 592.00 EUR
  • 10 rxns
  • 20 rxns

CometAssay Electrophoresis System

4250-050-ES Biotechne 1 Kit 2950.8 EUR

Cometslides Rack System

4252-040-02 Biotechne 1 Each 213.8 EUR

photo documentation system

VLBPCX4-20M Consort ea 6352 EUR

photo documentation system

VLBPCX4-20MX Consort ea 6774 EUR

photo documentation system

VLDP-HOOD Consort ea 5084 EUR

photo documentation system

VLDP17-26M Consort ea 8126 EUR

photo documentation system

VLDP17-26MX Consort ea 8464 EUR

AEC coloring system

CT356 U-CyTech 10-plate 141 EUR

SynaptoRed C2M, special packaging (also known as FM5-95): (5x1mg)

70019 Biotium 5ST 401 EUR

CMV-hspCas9-T2A-Puro SmartNuclease Lentivector Plasmid + LentiStarter Packaging Kit

CASLV100PA-KIT SBI 1 Kit 1132 EUR

CMV-hspCas9-EF1-GFP SmartNuclease Lentivector Plasmid + LentiStarter Packaging Kit

CASLV105PA-KIT SBI 1 Kit 1132 EUR

MSCV-hspCas9-T2A-Puro SmartNuclease Lentivector Plasmid + LentiStarter Packaging Kit

CASLV120PA-KIT SBI 1 Kit 1132 EUR

MSCV-hspCas9-EF1-GFP SmartNuclease Lentivector Plasmid + LentiStarter Packaging Kit

CASLV125PA-KIT SBI 1 Kit 1132 EUR

sequencing system 20x50 cm

ESEQ1200-SYS Consort ea 1535 EUR

modular system 10x10 cm

EVS1100-MULTI Consort ea 1197 EUR

modular system 20x10 cm

EVS1200-MULTI Consort ea 1451 EUR

modular system 20x20 cm

EVS1300-MULTI Consort ea 1958 EUR

vertical system 10x10 cm

EVS3100-SYS Consort ea 775 EUR

vertical system 20x10 cm

EVS3200-SYS Consort ea 1451 EUR

vertical system 20x20 cm

EVS3300-SYS Consort ea 1704 EUR

mini system 7x8 cm

EHS3100-SYS Consort ea 437 EUR

mini system 8x10 cm

EHS1050-SYS Consort ea 352 EUR

Fast MultiSite Mutagenesis System

abx098861-10rxns Abbexa 10 rxns 690 EUR

myGel Mini Electrophoresis System

BM0286 GenDepot System 618 EUR

96-Well Vacuum System

SD5011 Bio Basic 1 UNIT 324.05 EUR

amfiRivert Reverse Transcription System

R5200-050 GenDepot 50 rxns 388 EUR

EasyDip Slide Staining System

M900-12AS-ASSORTED ScyTek Laboratories 1 Case(s) 176 EUR

cfMAX cfDNA Isolation System

CFMAX100A-1 SBI 1 Kit 479 EUR

Episomal iPSC Reprogramming System

SC900A-1 SBI 5 reactions 968 EUR

FractionPREP Cell Fractionation system

55R-1359 Fitzgerald 50 assays 758 EUR

mini vertical system 10x10 cm

EVS1100-SYS Consort ea 606 EUR

mini vertical system 20x10 cm

EVS1200-SYS Consort ea 859 EUR

maxi vertical system 20x20 cm

EVS1300-SYS Consort ea 1138 EUR

data acquisition system 120 vac

D230-US Consort ea 1704 EUR

AXYGEN® GEL DOCUMENTATION SYSTEM

GD-1000 CORNING 1/pk 4670 EUR

EpiNext DNA Purification HT System

P-1063 EpiGentek 480 ml 6022.55 EUR

Platinum Retroviral Expression System, Ecotropic

VPK-300 Cell Biolabs 1 kit 1169 EUR

Platinum Retroviral Expression System, Amphotropic

VPK-301 Cell Biolabs 1 kit 1169 EUR

Platinum Retroviral Expression System, Pantropic

VPK-302 Cell Biolabs 1 kit 1169 EUR

Rabbit Reticulocyte Lysate System (untreated)

20-abx800016 Abbexa
  • 6759.00 EUR
  • 5924.00 EUR
  • 4281.00 EUR
  • 100 ml
  • 500 ml
  • 50 ml

SequaGel Sequencing System 1L Kit

NAT1136 National Diagnostics 1KIT 143 EUR

SequaGel Sequencing System 2.2L Kit

NAT1138 National Diagnostics EACH 211 EUR

HISTAR DETECTION SYSTEM Kits (OKSA11259)

OKSA11259 Aviva Systems Biology 50 Tests 565 EUR

HISTAR DETECTION SYSTEM Kits (OKSA11260)

OKSA11260 Aviva Systems Biology 150 Tests 1335 EUR

HISTAR DETECTION SYSTEM Kits (OKSA11261)

OKSA11261 Aviva Systems Biology 500 Tests 2019 EUR

Manual Staining System (12 Wells)

IMS001 ScyTek Laboratories 1 ea. 356 EUR

Slidefile Storage System 100 Positions

M700-100W-WHITE ScyTek Laboratories 1 Case(s) 192 EUR

Stain Tray Slide Staining System

M920-1 ScyTek Laboratories 1 Clear 428 EUR

Stain Tray Slide Staining System

M920-2 ScyTek Laboratories 1 Black 445 EUR

Gryphon Retroviral Expression System I

ABP-RVK-10001 Allele Biotech 1 set Ask for price

Gryphon Retroviral Expression System II

ABP-RVK-10002 Allele Biotech 1 set Ask for price

Gryphon Amphotropic Packaging Cell Line for Retrovirus (1 x 106 cells, Frozen)

ABP-RVC-10001 Allele Biotech 1 vial Ask for price

Gryphon Amphotropic Packaging Cell Line for Retrovirus (1 x 106 cells, Culture)

ABP-RVC-10001C Allele Biotech 1 flask Ask for price

Gryphon Ecotropic Packaging Cell Line for Retrovirus (1 x 106 cells, Frozen)

ABP-RVC-10002 Allele Biotech 1 vial Ask for price

Gryphon Ecotropic Packaging Cell Line for Retrovirus (1 x 106 cells, Culture)

ABP-RVC-10002C Allele Biotech 1 flask Ask for price

AXYGEN® GEL DOCUMENTATION SYSTEM BL

GDBL-1000 CORNING 1/pk 7632 EUR

Estendiamo questa tecnica alle applicazioni di editing genetico e mostriamo come può essere utilizzata per disattivare e disattivare il gene del recettore degli estrogeni, il gene responsabile del 70% dei casi di cancro al seno. Questa nuova tecnica è automatizzata con capacità di multiplexing che hanno il potenziale per standardizzare l’ingegneria del genoma basata su virus.