Espressione genica condizionale mediata da lentivirus

• Il plasmide di espressione  del lentivirus   viene prima progettato per contenere il gene di interesse guidato dal promotore TRE (elemento di risposta alla tetraciclina) in una semplice fase di clonazione del gate, e quindi co-trasfettato nelle cellule HEK293T insieme ai   plasmidi di  confezionamento e involucro per   produrre il virus.
• Il virus viene utilizzato per infettare il tipo cellulare di interesse a un MOI basso tale che la maggior parte delle cellule trasdotte contenga una singola integrazione virale. Le cellule infette vengono coltivate con la selezione e l’integrazione del virus viene verificata mediante qPCR.
• L’espressione genica nelle cellule trasdotte stabilmente è indotta dalla doxiciclina e convalidata da qPCR, immunoblotting e citometria a flusso.
•   Questa piattaforma di espressione  lentivirale flessibile   può essere utilizzata per indurre in modo stabile e forte un gene di interesse in una varietà di cellule per una varietà di applicazioni. Riepilogo grafico: una panoramica schematica della  trasduzione lentivirale   nelle cellule THP-1.

• La concentrazione del virus dell’ultracentrifuga ha determinato un titolo del virus più elevato a oltre 5×105  ^unità infettive   /ml (IFU/ml). Infine, la concentrazione inibitoria minima (MIC) del marcatore di selezione della puromicina era di 10 µg/ml e 7 µg/ml per HEK293T e CC, indicando l’utilità della selezione di antibiotici per tutti i tipi cellulari. Questi dati incoraggianti possono essere estrapolati e applicati ad altre cellule difficili da trasfettare, come diversi tipi di cellule staminali o cellule primarie.

Sistema cellulare di confezionamento inducibile per la produzione sicura ed efficiente di vettori lentivirali in assenza di proteine ​​helper dell’HIV-1.

• I vettori lentivirali basati sul virus dell’immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) hanno la capacità di fornire geni esogeni a cellule in divisione e non e quindi stabilire un provirus stabile in queste cellule bersaglio, che può consentire l’espressione a lungo termine del trasferimento gene. Qui descriviamo una linea cellulare di confezionamento stabile che è priva di HIV-1 tat, vif, vpr, vpu e nef. Al fine di evitare qualsiasi rischio di citotossicità associato all’espressione costitutiva della proteasi HIV-1 o  della proteina dell’involucro VSV-G, la trascrizione del pacchetto e dei costrutti dell’involucro è stata strettamente controllata mediante l’uso di un sistema indotto da ecdisone  .
• Usando questa linea cellulare, siamo stati in grado di generare costantemente stock concentrati di vettori virali pseudotipizzati con titoli nell’intervallo di 10 (8) UI / ml, che possono trasdurre in modo efficiente cellule in vitro che si dividono attivamente e inibiscono la crescita. Questa nuova linea cellulare di confezionamento di vettori lentivirali facilita la produzione di stock di virus ad alto titolo in assenza di virus competenti per la replicazione e ci fornisce uno strumento importante per la futura ricerca sul trasferimento genico.

Generazione,   confezionamento  e trasduzione di virus su piattaforma microfluidica digitale