L’efficacia del nuovo metodo PCR con una sonda di spegnimento nel rilevare le mutazioni dell’rRNA 23S nei bambini con infezione da Mycoplasma pneumoniae

• • Recentemente è stato sviluppato un kit diagnostico molecolare rapido automatizzato (Smart Gene Myco) per la rilevazione individuale dei geni di Mycoplasma pneumoniae (MP). Questo nuovo approccio ai test non richiede attrezzature o abilità speciali e può essere completato in 50 minuti. Abbiamo valutato prospetticamente questo kit diagnostico, insieme ad altri test convenzionali, per la diagnosi di polmonite nei bambini. Campioni di 98 bambini  (50 ragazzi e 48 ragazze; età 1-14; media: 4,7 ± 2,1 anni; mediana: 4 anni) con diagnosi clinica di polmonite sono stati testati per MP utilizzando la reazione a catena della polimerasi nel tempo reale (RT-PCR) come metodo di riferimento  . I risultati di tre test diagnostici molecolari, anticorpi anti-MP sierici e colture MP sono stati confrontati con i dati RT-PCR.
  • Tra 98 bambini, 38 sono risultati positivi al MP. Tutti i risultati della diagnostica molecolare hanno mostrato pieno accordo con i dati RT-PCR. La sensibilità della coltura era del 64%, mentre la sensibilità dei kit ImmunoCard Mycoplasma e SERODIA Myco II era inferiore (39% e 29% rispettivamente). Inoltre, è stata trovata una correlazione positiva significativa tra il numero di copie MP e la sensibilità del test colturale (r = 0,95, p = 0,048). Mutazioni di resistenza ai macrolidi nel gene dell’RNA ribosomiale 23S sono state rilevate in 24 su 38 bambini con lo Smart Gene Myco basato sulla PCR con la sonda di spegnimento, confermate dal sequenziamento diretto, rivelando tutte le mutazioni come A2063G. Questo è il primo studio per valutare l’utilità clinica dello Smart Gene Myco Kit.

  Rilevazione rapida e specifica delle infezioni da Mycoplasma gallisepticum e Mycoplasma synoviae nel pollame mediante test PCR singoli e duplex.

  La micoplasmosi aviaria, causata principalmente da Mycoplasma gallisepticum (MG) e Mycoplasma synoviae (MS), è una malattia economicamente importante dell’industria avicola. Lo scopo di questo studio era sviluppare la PCR duplex come metodo rapido, specifico ed economico per rilevare accuratamente MG e MS nel pollame e confrontarlo con una singola PCR MG/MS (monoplex). Nel presente studio sono stati testati un totale di 146 allevamenti di pollame con una storia clinica di malattie respiratorie. Campioni di tessuto in pool (trachea, polmone e sacche d’aria) da 3 a 4 uccelli da ciascun gregge sono stati raccolti durante l’autopsia presso i Disease Research Laboratories, Hisar, Haryana, India. I test PCR singoli e duplex sono stati standardizzati utilizzando primer intergeniciregione spaziatrice (IGSR; 16S-23S rRNA) per il gene MG ed emoagglutinina vlhA per la SM, con una dimensione prevista dell’amplicone rispettivamente di 812 bp e 1200 bp  .
  In una singola reazione PCR, campioni di tessuto del 6,85%, 2,74% e 2,74% erano positivi rispettivamente per MG, MS e sia MG che MS. Tuttavia, la PCR duplex ha mostrato rispettivamente il 7,53%, il 2,74% e l’1,37% di positività per MG, MS e sia MG che MS. Prendendo i risultati della PCR monoplex come gold standard, la sensibilità e la specificità della PCR duplex sviluppata erano rispettivamente del 94,44% e del 100%. Inoltre, la statistica kappa di Cohen (k = 0,97) ha misurato un accordo “eccellente” tra i test PCR monoplex e duplex. I valori predittivi positivi e negativi della PCR duplex sono risultati rispettivamente di 1,0 e 0,9922, con un intervallo di confidenza (CI) del 95%, rispetto alla PCR monoplex. L’uso simultaneo di due geni in una reazione PCR duplex era più veloce ed economico di due reazioni PCR singole separate.

  Rilevamento   multiplex PCR di   specie   Mycoplasma   associate a bovini da latte in Argentina

  • Ci sono poche informazioni sulla prevalenza, le caratteristiche epidemiologiche e cliniche associate alla presenza di Mycoplasma spp negli allevamenti da latte argentini. Lo scopo di questo studio era di sviluppare una PCR multiplex per l’identificazione di M.bovis e M.canadense e di descrivere l’incidenza di Mycoplasma spp.. Isolato da  campioni clinici sottoposti a un laboratorio diagnostico. Dei 1.548 campioni dall’infezione della mammella, latte dalle vasche di raccolta e fluidi biologici, sono stati ottenuti 38 isolati di micoplasma. M. bovis, M. canadense, M. californicum e M.leachii sono stati rilevati da due reazioni multiplex PCR, confermando la loro presenza clinica nei bovini da latte. Le tecniche utilizzate in questo studio potrebbero essere utili per migliorare la nostra comprensione delle infezioni da Mycoplasma nei bovini, poiché la ricerca di questi organismi di solito non è inclusa nelle diagnosi di routine.

  Utilità della   PCR Q-probe   nei bambini con  infezione da Mycoplasma   pneumniae

  Per studiare l’utilità della reazione a catena della polimerasi di spegnimento della sonda (Q-probe PCR) per il rilevamento di Mycoplasma pneumoniae (MP) resistente ai macrolidi, abbiamo analizzato retrospettivamente il decorso clinico di 21 bambini con infezione da MP. La percentuale di MP resistenti ai macrolidi era del 66,7%. La durata della febbre dopo il trattamento antibiotico iniziale era più lunga nei pazienti con infezione da MP resistente ai macrolidi rispetto ai pazienti con infezione da MP sensibile ai macrolidi. La durata della febbre dopo la PCR Q-probe non differiva significativamente tra i pazienti con infezione da MP resistente ai macrolidi e pazienti con infezione da MP sensibile ai macrolidi. Questi risultati suggeriscono che l’uso di antibiotici basati sulla PCR Q-probe ridurrà la durata della febbre. Q-probe PCR contribuisce alla determinazione di antibiotici appropriati e al miglioramento del decorso clinico dell’infezione da MP.

  Sviluppo di un nuovo  test PCR   con SYBR Green I per la rilevazione di   Micoplasma  , Acoleplasma  e   Ureaplasma sp.in   colture cellulari

  1. Mycoplasma  ,   Acholeplasma  e   Ureaplasma   sp. Sono batteri atipici responsabili della contaminazione delle colture cellulari in vitro, che possono falsare i risultati. Questi batteri causano anche infezioni negli esseri umani e negli animali e possono portare a malattie croniche. Nella reazione a catena della polimerasi (PCR) sviluppata in questo studio, è stata utilizzata la PCR quantitativa con il fluorocromo SYBR Green I per facilitare il   rilevamento e l’identificazione del DNA di Mycoplasma  ,   Acholeplasma  e   Ureaplasma   sp.
  2. Il test di screening-1 v.1 (triplo qPCR) ha rilevato 11 specie. Test-1 v.2 (tre singole qPCR) inizialmente ha identificato tre sottogruppi, limitando così l’uso di singole qPCR  nel Test-2 per l’identificazione delle specie. Lo scopo di entrambi i test era in linea con i requisiti della farmacopea per il controllo della qualità microbica delle cellule di mammifero e includeva il rilevamento di   M.  arginini, M. orale, M. hyorhinis,   M.  fermentans   ,  M.   genitalium  ,   M.  hominis   ,  M.   pneumoniae  ,   m. salivarium  ,   M. pirum  ,   A.  laylawii e   U. urealyticum. Il limite di rilevamento variava da 125-300 a 50-100 copie per millilitro rispettivamente nel test-1 e nel test-2.
  3. Il test-1 e il test-2 hanno mostrato risultati completamente coerenti, risparmiando tempo per il rilevamento e/o l’identificazione di specie selezionate di   micoplasma  ,   acoleplasma  e   ureaplasma   nelle colture cellulari testate.

Predizione   di Mycoplasma   pneumoniae e Chlamydophila pneumoniae nella polmonite acquisita in comunità (CAP): uno studio epidemiologico delle infezioni respiratorie  mediante saggi PCR multiplex

• La polmonite acquisita in comunità (PAC) è una malattia comune che può portare alla mortalità. I β-lattamici sono inefficaci contro i patogeni atipici, compreso il Mycoplasma pneumoniae. Abbiamo utilizzato studi molecolari per sviluppare un albero decisionale per predire i patogeni CAP atipici e per studiare la prevalenza della resistenza ai macrolidi in Mycoplasma pneumoniae.
• Abbiamo condotto uno studio osservazionale prospettico su pazienti di età ≥ 18 anni con febbre e sintomi respiratori a cui è stata diagnosticata la CAP in uno dei due ospedali comunitari tra dicembre 2016 e ottobre 2018.
• Abbiamo valutato  le combinazioni di variabili cliniche che meglio predicevano i patogeni atipici associati alla CAP mediante l’analisi dell’albero di classificazione e regressione (CART) . La polmonite è stata definita come sintomi respiratori e nuova infiltrazione diagnosticata mediante radiografia del torace o TC del torace.
• Abbiamo analizzato 47 pazienti (21 donne, 44,7%, età media 47,6 anni). Patogeni atipici sono stati rilevati in 15 pazienti (31,9%; 12 Mycoplasma pneumoniae, 3 Chlamydophila pneumoniae). Dieci pazienti avevano Mycoplasma pneumoniae resistente ai macrolidi (tasso di resistenza ai macrolidi 83,3%). L’analisi CART ha suggerito che i fattori associati alla presenza di agenti patogeni atipici erano non cracking, età <45 anni e LD ≥ 183 U/L (sensibilità 86,7% [59,5, 98,3], specificità 96,9% [83,8, 99,9]).
• I nostri semplici principi decisionali clinici possono essere utilizzati per identificare i pazienti delle cure primarie con CAP che sono a rischio di patogeni atipici. Sono necessarie ulteriori ricerche per confermare la sua idoneità a diverse popolazioni.Registrazione dello studio Studio clinico (ID studio UMIN: UMIN000035346).

Confronto di tre  metodi PCR in tempo reale per il rilevamento del Mycoplasma   genitalium  resistente ai macrolidi   in Svezia